Online video hd
Free video online
Официальный сайт filipoc 24/7/365
Смотреть видео бесплатно
|
||||||||||||
|
РефератыОстальные рефераты (1255)Микробная утилизация полиароматических углеводородов
Размер: 72.53 KB
Скачан: 102 Добавлен: 13.10.2005 1.Реферат Работа посвящена актуальной проблеме современной экологической биотехнологии - микробной утилизации полиароматических углеводородов (ПАУ). В рамках работы проведены: поиск и селекция штаммов ПАУ- резистентных грибов, подбор питательных сред и адаптация к ним отобранных штаммов, исследованы процессы деструкции смеси ПАУ грибами Trichoderma linorum и 2.Содержание 3.Введение.......................................................... 4.Аналитический обзор............................................................... 5.Цели и задачи исследования........................................................ 6.Патентный поиск............................................................... 7.Экспериментальная часть............................................................... 8.Стандартизация.................................................... 9.Охрана труда и окружающей среды............................................................... 10.Технико-экономическая оценка результатов исследования...................................... 11.Выводы и предложения......................................................... 12.Список использованной литературы.......................................................... 3.Введение 3.1.Актуальность проблемы Интенсивное развитие химической и обрабатывающей промышленности привело к интенсивному накоплению в природных биоценозах значительных количеств токсичных веществ, что, в свою очередь, обусловило развитие исследований в области охраны окружающей среды. Ведущее значение в изучении проблемы экологической безопасности играет биотехнология, так как все основные реакции детоксикации или частичной химической модификации токсичного субстрата связаны с метаболической активностью микроорганизмов. Вместе с тем, в решении экологических проблем до последнего времени (5-7 лет назад) доминировало традиционное направление- мониторинг объектов окружающей среды и определение ПДК экотоксикантов. Сегодня ведутся работы по использованию штаммов- деструкторов экотоксикантов в очистных сооружениях /1/, но вопросы биодеградации токсичных веществ непосредственно в природных биоценозах (биоремедиации) и создания промышленных технологий, позволяющих очищать природные ландшафты от техногенных загрязнений разработаны недостаточно. Среди веществ-экотоксикантов полиароматические соединения занимают одно из первых мест по урону, наносимому окружающей среде. Все эти вещества имеют в своей структуре бензольное кольцо, которое содержится в природном полимере лигнине, являющимся, наряду с целлюлозой, одним из основных компонентов древесины. Показано В этой связи представляется перспективной селекция древоразрушающих микроорганизмов в направлении создания штаммов- деструкторов ароматических экотоксикантов, способных разрушать эти вещества в природных биоценозах и промышленных очистных сооружениях. 3.2.Состояние разработки проблемы В России и СНГ: В России и СНГ (в основном на Украине) активно ведутся работы по поиску штаммов-деструкторов отходов коксохимической промышленности /4/. Изучаются молекулярно- биологические аспекты деструкции ПАУ. Следует отметить, что большинство работ выполнено с использованием бактерий рода В других странах: Анализ доступной литературы показал, что в 1.В почву единовременно или через определенные интервалы вносится суспензия микроорганизмов, которые разлагают вещества- загрязнители. 2.В почву вносится специальная питательная среда, содержащая азот, фосфор, микроэлементы и стимуляторы роста микроорганизмов. В состав смеси входят добавки, способствующие солюбилизации гидрофобных соединений. При использовании таких сред почвенная микрофлора разлагает экотоксиканты значительно быстрее. 3.Совместно используются питательные среды и микроорганизмы и/или производится предобработка субстрата. Американские ученые показали эффективность предобработки экотоксикантов УФ-светом с последующей их утилизацией грибом Phanerochaete chrysosporium и запатентовали данный процесс /9/. В США и странах Европы исследованы процессы разрушения таких конденсированных систем как нафталин, антрацен, фенантрен, пирен и др./10,11/. Исследованы генетические аспекты деградации ароматических экотоксикантов /12,13/. Однако исследования носят узко специализированный характер-изучаются процессы деструкции одного вещества (в случае смеси исследуется лишь суммарное содержание веществ либо число компонентов, не превышающее 3-5). Резюмируя вышеперечисленное можно сказать, что сегодня в 3.3.Научная новизна работы Предложена модифицированная среда Ван-Итерсона для выделения и селекции ПАУ-резистентных грибных культур; впервые изучен процесс деструкции смеси ПАУ, состоящей из 16-ти веществ грибами 4.Аналитический обзор 4.1.ПАУ-производные компонентов древесины 4.1.1.Химический состав и структура древесины 4.1.1.1.Целлюлоза Основным компонентом древесины является целлюлоза, ее содержание в древесине различных пород варьируется от 34,2% Растительные ткани древесины представляют собой сочетание клеток разнообразной формы, имеющих сложное строение целлюлозной стенки, состоящей из 3-х слоев /16/. Первичные клеточные стенки соседних клеток соединены между собой когезивным межклеточным веществом-срединной пластинкой. В период роста срединная пластинка на 2/3 состоит из пектиновых веществ, затем происходит ее лигнификация /17/. Вторичная клеточная стенка наиболее утолщена и образует большую часть клеточной стенки. Она состоит главным образом из целлюлозы и представляет собой множество концентричных слоев параллельно расположенных вдоль оси микрофибрилл целлюлозы. По современным данным макромолекула целлюлозы-это линейный полимер (-D глюкопиранозы с (-1,4-гликозидными связями между мономерами. В строение древесины, в обеспечение ее механической прочности и взаимодействии с микробными ферментами важную роль играют участки целлюлозы с высокой степенью упорядоченности фибрилл-такие участки получили название кристаллические, в отличие от аморфных участков с беспорядочной ориентацией. Аморфная целлюлоза, в силу менее плотной Надмолекулярная структура целлюлозы представлена элементарными фибриллами или мицеллами, диаметр которых составляет 4.1.1.2.Лигнин Наряду с целлюлозой, важным компонентом растительной ткани является лигнин. Лигнин- один из самых устойчивых и широко распространенных органических полимеров в природе. Он накапливается в клеточной стенке и в промежутках между целлюлозными волокнами, что придает древесине дополнительную прочность и устойчивость к химическим воздействиям. В состав древесины входит от 17,6% ( Populus tremuloides Лигнин- сложный трехмерный полимер фенольной природы, в котором оксифенилпропановые мономеры соединены между собой эфирными и С-С связями /24/. Роль мономеров играют различные оксифенилпропановые спирты: конифериловый ( в древесине хвойных деревьев), синановый (в древесине лиственных растений) и n- кумаровый (в травянистых растениях) /Рис.1./. [pic][pic] [pic] Рис.1. Структуру лигнина, в отличии от целлюлозы, нельзя описать простой комбинацией одной или нескольких мономерных единиц с одним типом связи. В связи с этим структура лигнина является предметом моделирования. Последняя модель, построенная на основе информации полученной при изучении соснового (Pinus taeda) лигнина, включает Важной способностью лигнина является его способность образовывать тесную ассоциацию с полисахаридными частями клеточной стенки- лигноцеллюлозные или лигноуглеводные комплексы, в формировании которых главную роль выполняют ковалентные связи. На электронных микрофотографиях елового лигнин-полиозного комплекса видно, что полиозы внедрены в лигнин, а так же сильно закручены и перевиты вместе с ним. Чаще всего с лигнином связаны боковые ответвления полиоз- звенья арабинозы, галактозы и 4-О- метилглюкуроновой кислоты. Показано, что лигноуглеводные комплексы богаты именно этими сахарами /28,32/. При воздействии микроорганизмов на древесину лигнин, ассоциированный с полисахаридами клеточной стенки, является основным препятствием для действия микробных ферментов на целлюлозу растительных тканей. 4.1.1.3.Экстрактивные вещества Экстрактивные вещества играют огромную роль в жизни дерева и обуславливают многие свойства древесины (цвет, запах, резистентность к фитопатогенам и т.д.). При нормальных условиях доля этих веществ составляет в среднем не более 5%, причем у различных видов их содержание неодинаково, так например в древесине Химический состав экстрактивных веществ чрезвычайно разнообразен, однако в свете данной работы нас интересуют лишь их ароматическая фракция. Ароматические терпены. Содержание ароматических терпенов в древесине хвойных пород ничтожно и единственным примером соединений такого рода является представитель класса монотерпенов (-цимол Рис.2. Лиственные породы богаче ароматическими терпенами: в древесине видов Ulmus, Celtis и Zelkowa найдены 5 видов ароматических сесквитерпенов, среди которых наиболее интересны лацинилен А и 7- гидроксикадаленаль, содержащие нафталиновое ядро (с.рис.2.) Простые фенолы. Среди простых фенолов, выделенных их экстрактивных веществ ели (Picea abies), присутствуют ванилин, n- гидрокси-бензойальдегид, конифериловый альдегид, гваяцилглицерин, n- этилфенол, кониферил и сирингин, а так же крезол и другие фенолы. В экстрактах древесины Quercus alba обнаружили ряд фенолов, среди которых присувствовали синаповый, конифериловый, сиреневый альдегиды, ванилин, пропионгваякол и n-гидроксибензальдегид. В древесине дуба найдены фенол, крезолы, гваякол, n-этилфенол, эвгенол и другие фенольные соединения. Лигнаны. Лигнаны-соединения, состоящие из двух фенилпропановых единиц, соединенных различными способами. Некоторые из этих соединений аналогичны димерным структурам, присутствующим в макромолекуле лигнина. Многие лигнаны, найденные в экстрактах древесины видов Picea, Pinus, Larix и Tusida содержат цикл тетрагидрофурана, например пинорезинол, лариццирезинол, конидендрин и лиовил. Существуют так же и нециклические структуры с (-( связями между структурными единицами (секоизоларицирезинол) и шестичленные циклы (изоларицирезинол, конидендрин, пликатин). Из древесины Thuja plicata выделен пликатинафтол-лигнан, содержащий нафталиновое ядро(рис.3.)/15/. Рис.3. 4.1.2.Карбонизация древесины. Процессы образования конденсированных ароматических систем После гибели дерева древесина либо разлагается микроорганизмами либо, в некоторых природных условиях превращается в ископаемую древесину. Различают два типа процесса образования ископаемой древесины: силикатизацию (окаменение) и карбонизацию (углификацию). В свете нашей работы интерес представляют химические процессы, происходящие при карбонизации древесины. Рассмотрим их более подробно. Химический анализ образцов старой и ископаемой древесины указывает на уменьшение содержание полисахаридов и возрастание количества негидролизуемого остатка по мере увеличения возраста и степени деградации. У относительно молодых, но сильно деградированных образцов обнаружили присутствие микроорганизмов. Из результатов исследований древних образцов дуба, а также образцов березы, ясеня и сосны видно, что на степень деградации влияют окружающие условия, особенно на ранних стадиях. Некоторые старые образцы (возрастом 8500 лет) содержали больше полиоз, чем молодые (возрастом 900 лет). По увеличению относительного содержания целлюлозы в образцах деградированной древесины видно, что превращения начинаются с полиоз. Быстрее разрушаются легкорастворимые полиозы, в частности пентозаны, чем труднорастворимые. Массовая доля полиоз, растворимых в 5%-ным КОН в ядровой древесине современного образца дуба Деградация полисахаридов начинается на ранних стадиях процесса, однако некоторая часть полисахаридов может сохраняться многие миллионы лет. В образце древесины хвойной породы возрастом Лигнин способен сохраняться в течении миллионов лет, но в то же время он может претерпевать изменения даже и за относительно короткие промежутки времени. В молекулах лигнина образцов древесины возрастом 900-4400 лет обнаружили окислительные превращения. В настоящее время каменный уголь является основным источником 4.1.3.Полиароматические соединения каменноугольной смолы Каменноугольная смола (креозот) образуется при коксовании каменного угля и является основным источником ПАУ для химической промышленности. Именно креозот является основным источником ПАУ- экотоксикантов. В составе каменноугольной смолы нами были обнаружены 16 ПАУ, а именно: нафталин, аценафтен, аценафтилен, флуорен, фенантрен, антрацен, флуорантен, пирен, бензантрацен, хризен, бенз[b]флуорантен, бенз[k]флуорантен, бенз[а]пирен, дибензантрацен, бензперилен, инденопирен (Рис.4.). Больше всего в креозоте содержится фенантрена и флуорантена. Суммарно эти вещества составляют 64% фракции ПАУ. Другие вещества, такие как бенз[а]пирен, хотя и составляют 0,7% фракции ПАУ являются сильнейшими канцерогенами. Химически эти вещества представляют собой многоядерные ПАУ. Рис.4.ПАУ каменноугольной смолы 4.2.Лигнин и ПАУ-разрушающие микроорганизмы Как было отмечено выше, естественным резервуаром микроорганизмов-деструкторов ПАУ являются почва и лесная подстилка. Грибы, разрушающие древесину, подразделяются на четыре группы: 1.Грибы бурой гнили- принадлежат к подотделу базидиомицетов, разрушают, главным образом, полисахариды древесины. 2.Грибы белой гнили- - принадлежат к подотделу базидиомицетов, разрушают, главным образом, лигнин, однако способны разрушать полисахариды. 3.Грибы мягкой гнили- сумчатые и несовершенные грибы, разрушают полисахариды и лигнин. 4.Грибы синевы- сумчатые и несовершенные грибы, живут, главным образом, за счет остаточных белков паренхимных клетках. 5.Бактерии- способны разрушать полисахариды и лигнин, однако, их морфологические свойства (колониальный рост) не позволяет им выступать в качестве высоко эффективных деструкторов при твердофазной ферментации. Таким образом, наиболее перспективными для отбора ПАУ- разрушающих штаммов являются грибы белой и мягкой гнили (базидио- и аскомицеты). Рассмотрим влияние их ферментных систем на природные ароматические вещества. 4.2.1.Воздействие грибов белой гнили Грибы белой гнили вырабатывают различные ферменты, способствующие усвоению лигнина /34/. Некоторые из грибов дают, преимущественно, лакказу, другие пероксидазу и тирозиназу. Процесс выработки ферментов различен в зависимости от того используется фермент внутри или вне гиф. У всех видов диких грибов обнаружена комбинированная деструкция всех компонентов древесины. Обнаружен фермент, который нуждается в целлобиозе (продукте разложения целлюлозы) для деструкции лигнина при совместном действии с локказой /15/.Этот фермент был назван целлобиозохиноноксиредуктазой. В дальнейшем было показано, что для разложения лигнина грибом Phanerohaete chrisosporium.(синоним Sporotrichum pulverolentum) наличие целлобиозохиноноксиредуктазы не является необходимым. Наличие же лакказы абсолютно необходимо. Мутант гриба, не вырабатывающий этой фенолоксидазы, не способен разрушать лигнин. Изменение в лигнине под воздействием грибов белой гнили заключается в увеличение содержания карбонильных и карбоксильных групп. Отношение О/С увеличивается, а Н/С понижается. Увеличение содержания кислорода происходит в результате окисления (-углеродных атомов и окислительной деструкции связей между (- и (-углеродными атомами пропановой цепи. В опытах с меченным (14С) лигнином показано, что при действии грибов белой гнили (Coriolus versicolor, 4.2.2.Воздействие грибов мягкой гнили Грибы мягкой гнили вырабатывают ферменты, разрушающие все компоненты древесины. Деструкция лигнина грибом Chaetomium globosum до общей потери массы древесины 12% заключается в деметилировании. 4.2.3.Действие бактерий Способность различных бактерий разрушать мономеры и предшественники лигнина показано в опытах с модельными соединениями Исследования по разрушению ПАУ почвенными бактериями показали, что псевдомонады являются наиболее эффективными деструкторами этих соединений. Исследования показали, что ПАУ эффективно разлагаются псевдомонадами в условиях глубинной и твердофазной ферментации, в ризосфере растений /37/. Исследования механизмов деструкции ПАУ (фенантрена) культурой Рис.5.Механизм деструкции фенантрена Способность разрушать природные ароматические вещества натолкнула исследователей на мысль об использовании микроорганизмов для разрушения ароматических и полиароматических веществ- отходов химической индустрии. В 1990 году американские исследователи показали, что разрушающие лигнин грибы белой гнили Phanerohaete chrysosporium способны также разлагать полициклические ароматические углеводороды до СО2 /38/. Была так же показана способность бактериальных штаммов разлагать ПАУ /39/. В настоящее время работы по микробной деструкции ПАУ ведутся, практически, во всех развитых странах. Показано /40/, что деструкция ПАУ идет последовательно и начинается с гидроксилирования только одного ароматического кольца (рис.6.). Рис.6.Гидроксилирование бензольного кольца. Упрощенная схема микробной деструкции нафталина Таким образом простые ПАУ должны разлагаться микроорганизмами гораздо быстрее чем такие ПАУ как пирен, хризен, 3,4бензпирен и другие. В соответствии с правилом последовательного окисления только одного ароматического кольца при деструкции смеси ПАУ должно происходить накопление полиядерных веществ, разрушение которых требует длительных сроков инкубации. Правило последовательного окисления действует для различных видов микроорганизмов. 5.Цели и задачи исследования Целью работы является изучение процессов биодеградации смеси вредных ПАУ микроорганизмами, разрушающими древесину и создание на их основе высокоэффективных штаммов-деструкторов указанных соединений. Задачи исследования сводятся к: 1)Поиску в коллекциях и выделению из природных биоценозов микроорганизмов-деструкторов вредных веществ и отбор наиболее активных штаммов; 2)Адаптации штаммов к условиям культивирования 3)Изучению процессов разрушения многокомпонентной смеси ПАУ в условиях твердофазной ферментации; 4)Изучению фотолиза ПАУ. 6.Патентный поиск Поиск патентной информации проводился на базе фундаментальной библиотеки СПбГТИ(ТУ), объединенной библиотеки ВИЗР и ВНИИСХМ, библиотеки АН, а также Российской Национальной библиотеки. Поиск осуществлялся по следующим направлениям: штаммы-деструкторы ароматических экотоксикантов, питательные смеси для очистки загрязненных почв, аппаратурное оформление процессов компостирования твердых отходов, методы предобработки отходов. По данным направлениям обнаружена следующая инормация: 1.Штамм актиномицетов Streptomyces rochei, осуществляющий полное разложение 2,4,6-трихлорфенола или 2,4-дихлорфенола или 2,6- дихлорфенола, или 2-хлорфенола: А.с. 1652335 СССР, МКИ5 С12 N 1/20, 2.Методы и установка для [проведения] аэробного ферментативного, в частности, для компостирования органических материалов. Verfahren und Vorrichtung zur aeroben, fermentativen 3.Фотолитически усиленное микробное разрушение [веществ] загрязняющих окружающую среду. Photochemically enhanced microbial degradation of enviromental pollutants: Пат. 5342779 США МКИ5 ВО9В 4.Улучшенная смесь питательных соединений для биологической очистки загрязненых почв и вод. Verbesserte Nahrstoffgemische fur die Bioremediation verschmutzter Boden und Cewasser: Заявка 4228168 5.Штамм бактерий - деструктор фенола, бензола и их галогензамещенных аналогов: Пат. 2041943 Россия, МКИ6 C12N 1/12, 7.Экспериментальная часть 7.1.Материалы и методы 7.1.1.Материалы 7.1.1.1.Штаммы микроорганизмов В нашей работе были использованы штаммы мицеллиальных грибов любезно предоставленные Ю.С.Оследкиным (ВНИИСХМ, г.Пушкин). В таблице №1 приводится список видов и номера штаммов, а также указывается доступная информация об источнике их происхождения (организации и/или географическом и/или экологическом происхождении). таблица 1 7.1.1.2.Питательные среды В работе были использованы следующие питательные среды: 1.Среда Ван-Итерсона /41/, г/л: NH4NO3 -0,5 KH2PO4 -0,5 полоска фильтровальной бумаги -1x12 см H2O -1 литр 2.Среда Ван-Итерсона модифицированная /42/: минеральный состав среды тот же, что и в классическом варианте, полоска фильтровальной бумаги инпрегнированна веществом, для которого отбирается штамм-деструктор содержание вещества составляет 5% от массы полоски бумаги 3.Среда Чапека /41/, г: KH2PO4 -1,0 NaNO3 -3,0 KCl -0,5 MgSO4.7H2O -0,5 FeSO4.7H2O -0,01 H2O -1 литр 4.Среда Чапека с сахарозой/41/: Минеральный состав без изменений, добалено 30 г/литр сахарозы 5.Сусло пивное неохмеленное /41/: Неохмеленное пивное сусло разводится в два раза водопроводной водой и стерилизуется Для получения твердых питательных сред добавляли 2 г/литр агар- агара. 7.1.1.3.Субстраты Для выделения, отбора, хранения и культивирования микромицетов использовали следующие субстраты (табл.2.): таблица 2 7.1.1.4.Пробы В работе были использованы образцы древесины телеграфных столбов, подвергшихся воздействию микроорганизмов (Новгородский регион), любезно предоставленныe Марьяновской Юлией Валентиновной 7.1.2.Методы 7.1.2.1.Выделение культур микромицетов Выделение первичных культур велось на модифицированной среде Выделение чистых культур велось на агаре Чапека с использованием стандартных микробиологических методов /43/. 7.1.2.2.Изучение морфологических и физиолого-биохимических свойств культур микромицетов Для изучения морфологических, культуральных и физиолого- биохимических свойств культур микромицетов использовали стандартные микробиологические среды и методы /41/. Цитоморфологические наблюдения проводили с помощью общепринятых методов и растворов красителей /41/. 7.1.2.3.Отбор штаммов-деструкторов ПАУ Отбор целлюлолитических штаммов мицеллиальных грибов оcуществляли на среде Чапека c целлюлозой и ПАУ (содержание ПАУ 5% от массы целлюлозного субстрата). Оценка роста производилась визуально. 7.1.2.4.Твердофазное культивирование микроорганизмов Культивирование мицелиальных грибов в твердой фазе проводили в кюветах емкостью 0,5 л и бутылях емкостью 30 л. Содержание среды в кюветах-250 г, в бутылях-2,5 кг. Культивирование мицеллиальных грибов проводилось на специально разработанных средах, представляющих собой измельченную древесину, инпрегнированную ароматическими веществами и увлажненную раствором солей и сахаров. Объем увлажняющей жидкости составлял 200- Посевной материал для кювет выращивали на чашках Петри на тех же средах. Чашки Петри засевали суспензией спор, полученной путем смыва увлажняющей жидкостью с газона 7-суточной культуры на агаре 7.1.2.5.Фотолитическая обработка субстратов Субстраты помещали в кюветы, которые располагались под источником излучения на расстоянии 50-60 см. Чтобы избежать перегрева поверхности субстрата, лампа работала периодически, не более 4 часов в течении рабочего дня. В качестве источника излучения использовали газоразрядную лампу ПРК-7 ((max=257,3 нм). 7.1.2.6.Определение ПАУ в твердой фазе Экспериментальные образцы подвергались сушке в термостате при Экстракцию ПАУ осуществляли в аппарате Сокслета в течении 6 часов. В качестве экстрагента использовали предварительно очищенный от примесей углеводородов гексан. Полученный экстракт упаривали до небольшого (4-5мл) объема. Газхроматографический анализ сконцентрированных компонентов проводили на хроматографе ’’Цвет-570М’’ с пламенно-ионизационным детектором на кварцевой капиллярной колонке (30м, 0,25мм) с неподвижной фазой DB-5 при программном повышении температуры от 70 до 320ОС со скоростью 4ОС в минуту. Количественные данные получали методом абсолютной градуировки детектора стандартными растворами Идентификацию компонентов смеси осуществляли хромато-масс- спектрометрически на приборе LKB-2091 фирмы LKB-BROMMA (Швеция). 7.2.Результаты и обсуждение 7.2.1.Направленный поиск микромицетов-деструкторов ПАУ Микробная деструкция экотоксикантов в последние десятилетия стала объектом интенсивных исследований практически во всех развитых странах мира. Эффективность этого процесса определяется в первую очередь активностью штамма-деструктора экотоксикантов. Проведенные эколого-таксономические исследования показали, что представители микрофлоры лесной подстилки (рода Alternaria, Фитопатогенные грибы так же способны разрушать природные аромитические вещества (Fusarium) /34/. Обычно для выделения штаммов, разлагающих то или иное вещество, используют жидкие или агаризованные среды, содержащие это вещество как единственный источник углерода и энергии. Однако, по нашему мнению, для биоремедиации следует использовать микроорганизмы, сочетающие в геноме способность утилизировать как экотоксикант, так и целлюлозу, которая содержится в почве и является основным компонентом твердых отходов. Мы решили, что наилучшей средой для отбора микромицетов, разрушающих ПАУ в соокислительных условиях будет среда Чапека с целлюлозой и ПАУ. В качестве критерия отбора использовали общепринятый метод оценки роста культур мицеллиальных грибов по характеристике их роста в баллах через определенные, одинаковые для всех штаммов периоды времени. Такая методика позволяет отобрать наиболее резистентные и быстрорастущие штаммы. Для выделения ПАУ-резистентных целлюлолитиков из природных биоценозов на наш взгляд наиболее подходит среда модифицированная Из биоценоза свалки старых телеграфных столбов было отобрано Выделение первичной культуры велось на модифицированной среде Идентификация велась на сусло-агаре и среде Чапека. Было выделено и идентифицировано 5 штаммов: Trichoderma linorum,
Для проведения исследований мы использовали культуры, выделенные из техногенных биоценозов, а так же коллекционные, любезно предоставленные Оследкиным Ю.С. (разд. ). Отбор штаммов оcуществляли на среде Чапека с целлюлозой и ПАУ (содержание ПАУ 5% от массы целлюлозного субстрата). Оценка роста производилась визуально. Результаты представлены в таблице 4. таблица 4 Практически все исследуемые микроорганизмы обладали способностью расти и образовывать колонии на поверхности субстрата. 7.2.2.Микробная деструкция смеси ПАУ Анализ литературных данных показал, что основная масса работ по деструкции ПАУ посвящена изучению деструкции одного вещества или смеси ПАУ/6,11,14/, содержащей не более 5 компонентов. Однако в реальных условиях спектр ПАУ-экотоксикантов гораздо шире. Данные по деструкции многокомпонентных смесей ПАУ в доступной литературе отсутствуют. Между тем изучение процессов деструкции смеси экотоксикантов имеет очень важное значение для разработки процессов биоремедиации. Для изучения деструкции смеси ПАУ нами в качестве модельного субстрата была выбрана древесина шпал. Использование этого субстрата значительно упрощало работу так как отпадала необходимость работать с креозотом непосредственно. Для приготовления ферментационной среды субстрат измельчали до фрагментов размером около 5 мм и увлажняли жидкой средой Чапека с сахарозой (см.разд.7.1.). Посевной материал выращивали в чашках Анализ экспериментальных данных по деструкции ПАУ, приведенные в табл.45 показал, что различные по строению ПАУ разрушаются Trichoderma lignorum с различной скоростью. Простые В соответствии с правилом последовательного окисления только одного ароматического кольца сложные 4х-5ти ядерные ПАУ в меньшей степени подвержены полному распаду. Необходимо отметить, что на момент отбора проб для анализа в субстратах под воздействием микробных ферментов происходят сложные процессы изменения количественного соотношения ПАУ. Возможно этот процесс обусловлен явлением конденсации частично окисленных углеводородов. Для проверки этой гипотезы были проведены эксперименты с увеличением срока культивации. Исследования проводились с использованием ранее описанных методов и сред, однако были внесены некоторые изменения: 1.Применялись более крупные фрагменты, чем ранее. Линейные размеры фрагментов составляли 10х10х20 см (кубики). 2.При формировании среды в ферментационных емкостях объемом Посевной материал вносился в количестве 10%. Температура инкубации составляла 28ОС. Субстрат периодически увлажняли разбавленным водопроводной водой неохмеленным пивным суслом (2% сахаров). Культура Trichoderma lignorum № 37 активно колонизирует поверхность кубиков, причем начальное прикрепление и активное размножение начинается с чистых, не содержащих ПАУ кубиков. Такая последовательность, по-видимому, связана с адаптацией культуры и накоплением в среде активных ферментов. К исходу 20-х суток культура колонизирует до 70% поверхности субстрата. Отбор проб производился на 30-е и 40-е сутки инкубации. таблица 6 Как видно из представленных данных на 30-е сутки процесса микробной деструкции сохраняется накопление ПАУ, отмеченное раннее. По видимому для более полного разрушения ПАУ требуется более длительный срок ферментации. Результат анализов проб отобранных по истечении 40 суток убедительно показал, что только содержание инденопирена сохраняется на прежнем уровне (контрольный образец-1 мг/кг, 40-е сутки-1,3 мг/кг). Содержание всех остальных компонентов смеси к исходу 40-х суток резко снизилось и достигло минимальных значений. На 40-е сутки инкубации исчезает, отмеченное раннее явление накопления полиядернях компонентов смеси, связанное с конденсацией продуктов частичной деструкции. Параллельно нами был изучен процесс деструкции смеси ПАУ грибом Phanerochaete chrysosporium. Этот микроорганизм является самым перспективным среди микромицетов деструктором ароматических ксенобиотиков, ему посвящено огромное количество работ. Однако сведений по деструкции им многокомпонентных смесей ПАУ в литературе так же не оказалось. В этой связи имело смысл изучить данный вопрос. В соответствии с раннее описанными методиками был изучен процесс деструкции ПАУ. В качестве субстрата использовали кубики, анализ содержания ПАУ проводили методом хромато-масс-спектроскопии. Как следует из приведенных экспериментальных данных, гриб Таким образом подтверждается принцип последовательного окисления ПАУ и общность механизмов деструкции этих веществ у различных микроорганизмов. таблица 7 7.2.3.Применение облучения ((=257,3 нм) для предобработки ПАУ- содержащих субстратов В природных условиях ПАУ разлагаются под воздействием комплекса многочисленных факторов: микробной деструкции климатических условий и некоторых других. Солнечный свет несомненно должен оказывать влияние на ПАУ. Для проверки этого предположения нами была создана лабораторная установка (рис.3.) с газоразрядной лампой ПРК-7 ((=257,3 нм). Кюветы с измельченными фрагментами пропитанной креозотом древесины (фрагменты 5 мм) помещали в кюветы и подвергали облучению. Во избежание перегрева поверхности субстрата установка работала периодически, не более 4-х часов в сутки. Пробы отбирали по истечении 16-ти и 20-ти часов облучения. Из таблицы 8 видно, что под воздействием ультрафиолетового излучения происходит деструкция ПАУ. Зафиксировано снижение содержания нафталина, антрацена, флуорена и фенантрена в 10-20 раз. Следует отметить, что обнаруженное нами явление фотолиза ПАУ хорошо совпадает с раннее опубликованными данными. Так французские исследователи показали благоприятное воздействие фотолитической деструкции антрацена и его превращение в антрахинон для последующей деструкции ассоциацией морских микроорганизмов /47/. Авторы отмечают, что разрушение 50% антрахинона в глубинных условиях происходит за 10 суток. Анализ продуктов распада показал наличие следовых количеств бензойной и фталевой кислот (рис.7.). Рис.7.Процесс фотолитической деструкции антрацена Необходимо отметить, что окисление антрацена и его превращение в антрахинон, по видимому, является инициирующим фактором для последующей микробной деструкции. Анализ экспериментальных данных показывает, что бензперилен и инденопирен являются наиболее устойчивыми к действию облучения. Из раннее приведенных данных видно, что первоначальной общей стадией разложения ароматического кольца является его окисление. В дальнейшем такие структуры, как, например о-оксибензойная кислота, продукт разложения нафталина, легко вступают в реакции присоединения с более сложными продуктами деструкции, например, с окисленной формой пирена, с образованием и накоплением в системе инденопирена (рис.8.): Рис.8.Образование инденопирена Высказанное предположение и возможный механизм протекания реакций между продуктами деструкции нуждается в дополнительной экспериментальной проверке. Однако, явление фотолитической деструкции ПАУ можно использовать для предобработки этих веществ при проведении их микробной утилизации. 7.2.4.Происхождение микроорганизмов-деструкторов ПАУ Интенсивное промышленное воздействие на окружающую среду началось сравнительно недавно - в XIX веке. Очевидно, что за столь короткий промежуток времени не могли эволюционировать ферментные системы, способные разрушать ПАУ. Однако литературные данные Вероятнее всего, что появление первых микроорганизмов, разрушающих ПАУ следует отнести к эпохе появления первых сосудистых растений, содержащих лигнин в клеточной стенке - древовидных папоротников. Возраст самых древних папоротникообразных составляет около 380 млн. лет (конец Силурийского периода) /48/. Древесина современных растений содержит ряд веществ, имеющих в своем составе нафталиновое ядро /15/. Под воздействием солнечного света и микроорганизмов (собственные данные), а также при горении биомассы 7.2.5.Анализ возможности создания систем по утилизации твердых ПАУ- содержащих отходов В связи с ухудшением экологической обстановки перед исследователями встала задача разработки методов утилизации вредных отходов производства и коммунального хозяйства. Предложенные нами методы фотолитической предобработки техногенных, ПАУ содержащих субстратов, и их микробной деструкции позволяют создать производство по утилизации коммунальных отходов, содержащих ПАУ. Примером таких отходов является листовой опад крупных городов, загрязненнй как ПАУ, так и маслами, смолами и жидкими нефтепродуктами. Предобработку фотолизом можно осуществлять без особых затрат выдерживая субстраты на специальных площадках. Рис.9.Схема установки по утилизации ПАУ содержащих отходов 8.Стандартизация В работе использовались материалы, приборы, оборудование, посуда, отвечающие государственным и отраслевым стандартам. таблица 9 9.Охрана труда и окружающей среды Мероприятия, проводимые в разделе ’’Охрана труда и окружающей среды’’ очень важны, так как их выполнение обеспечивает безопаснос |
|
|
Смотреть онлайн бесплатно
Онлайн видео бесплатно